荧光光谱法和磷光光谱法（一）法和法是磷光常见的荧光分子-知新云阁

一、荧光引言

分子发光包括荧光、光谱光谱磷光、法和法化学发光和生物发光。磷光光与物质作用产生激发态分子，荧光其返回基态时的光谱光谱发光现象称为光致发光(photoluminescence)，荧光和磷光都是法和法光致发光。通过化学反应或生物反应产生激发态分子，磷光其返回基态时的荧光发光分别称为化学发光和生物发光。

可以产生光致发光的光谱光谱分子应在紫外-可见区有光吸收。多环芳烃和某些金属配合物分子结构中含有大平面π电子共轭体系，法和法是磷光常见的荧光分子，可以直接进行荧光分析。荧光对于那些无荧光或荧光较弱的光谱光谱分子，通过与荧光试剂反应后可进行间接荧光分析。法和法

荧光分析法具有灵敏度高(比紫外-可见分光光度法高2～3个数量级)，选择性好，工作曲线线性范围宽，且能提供激发光谱、发射光谱、发光强度、发光寿命、量子产率、荧光偏振诸多信息等优点，已成为一种重要的分析技术。在生物、医学、药物、环境、石油化工等诸多领域都有广泛的应用。以激光作为激发光源的激光诱导荧光法是公认的高灵敏度分析手段之一，可用于单细胞、单分子检测。荧光作为一种高灵敏度检测手段还经常与高效液相色谱、薄层色谱、毛细管电泳或流动注射等分析技术联用。

与荧光相比，磷光的发光寿命长，发光波长处于长波区，更易于消除其他物质，特别是生物体液中荧光物质的干扰，选择性更好。尤其是室温磷光分析法克服了传统低温磷光法中需要把试样预先冷却到液氮温度(77K)形成刚性玻璃体后再测定磷光的缺点，操作更为简便。

二、方法原理

基态分子在吸收光能后，其价电子从成键轨道或非键轨道跃迁到高能量的反键轨道上去，产生激发态分子，此即分子的光吸收过程。紫外-可见分光光度法就是基于分子的光吸收过程建立起来的分析方法。然而，激发态分子不稳定，通常会很快失去能量回到基态。如果激发态分子在返回基态时以光辐射的形式失去能量，则这种光辐射过程就称为光致发光。光致发光的光物理过程可用Jablonski图解说明(图15.1)。

基态分子吸收波长为λ₁或λ₂的光能，受激处于S₁或S₂激发态，通过振动松弛和内转换过程失去部分能量到S₁态的最低振动能级。从最低振动能级伴随光子的发射返回到基态S₀的各振动能级的过程，即S₁→S₀跃迁过程伴随的发光现象称为荧光。S₁和S₀能级间的能量差对应的波长就是荧光发射波长。荧光过程是单线态一单线态跃迁，受激电子的自旋状态不发生变化。若处于S₁态的分子基于自旋一轨道耦合作用，通过系间窜跃过程(内、外重原子存在，有助于此系间窜跃过程，称重原子效应)，由单线态的S₁态转入三线态的T₁态，继而通过振动松弛弛豫到T₁态的最低振动能级，再通过光辐射失去能量回到基态S₀各振动能级，此光辐射过程就称为磷光。显然，磷光波长要长于荧光波长，且由于S₁→T₁跃迁涉及到电子自旋状态的改变，属禁阻跃迁，磷光寿命(10^-4～10s)显著长于荧光寿命(10^-13～10^-7s)。处于T₁三线态的电子更容易通过碰撞等非辐射失活途径回到基态，因此常温溶液磷光不容易观测到。

在一定光源强度下，若保持激发波长λ_ex不变，扫描得到的荧(磷)光强度与发射波长λ_em的关系曲线，称为荧(磷)光发射光谱；反之，若保持λ_em不变，扫描得到的荧(磷)光强度与λ_ex的关系曲线，则称为荧(磷)光激发光谱，如图15.2所示。

对低浓度溶液样品而言，一定λ_ex和λ_em条件下测得的荧(磷)光强度If(I_p)可表示为:

式中，φ_f(φ_p)为荧(磷)光量子产率；I₀为激发光强度；b为液池厚度；ε和c分别为发光物质的摩尔吸光系数和浓度(mol／L)。由此可见，只要发光物质的浓度不是太大(εbc＜O.05)，在一定条件下，其荧(磷)光强度与其浓度成正比，这正是荧(磷)光分析的定量基础。图15.3是荧光强度与荧光物质浓度之间的关系曲线。低浓度段，荧光强度与浓度呈直线关系；高浓度段，荧光强度随浓度增加反而降低。式(15.1)还表明，荧光强度与入射光强度成正比，测定浓度很稀的溶液时，可以采用激光光源提高测定灵敏度。

式(15.1)、式(15.2)中发光量子产率φ一定时，发光强度才与浓度成正比。实际上，溶液浓度过大时φ会降低，荧光减弱，这种现象称为浓度猝灭。浓度猝灭的原因是由于浓度高时荧光分子彼此间的碰撞几率增大，非辐射碰撞失活导致荧光猝灭。分子间碰撞还与温度有关。温度升高，分子碰撞几率增加，荧光强度减弱，这种现象称为温度猝灭。卤代芳烃中，卤素原子的原子序数增加，荧光强度减弱，这种现象称为重原子效应。利用重原子效应是获得磷光辐射的重要途径之一。